关于单域抗体的概念本文不想累述。有关内容可以参见康宁杰瑞网站

作为小分子抗体的单域抗体有着与完整抗体同等的与抗原的结合能力，以及稳定性。按照教科书式的说法，单域抗体有如下优势：分子量小，组织渗透力强，可溶性好，有较好的与抗原结合的能力，稳定性好等特点。

有了上述优势，单域抗体从1993年被发现到现在，被广泛的应用于靶向引导剂，化学传感器，诊断试剂等特点，但是作为治疗性药物，虽然目前已有一些项目进入临床研究阶段，但未有成功上市的案例。

做为治疗性药物，单域抗体相对于传统抗体具有更快的血清清除速率，肾小球滤过率高，很容易被机体清除，其半衰期很短等缺点。因此，人们通过采用基因工程的方法将单域抗体与血清白蛋白，血清白蛋白的纳米抗体，免疫球蛋白，免疫球蛋白的Fc片段融合等方案来设法延长单域抗体在血清中的半衰期。此外，由于VHH仅为一个重链可变区，人们会构建其多价抗体或者双特异性抗体的方法来提高其亲和力或增加其功能。

图1传统抗体与重链抗体以及单域抗体的区别（来自http://www.genscript.com.cn）

如下图所示。首先免疫文库的构建，噬菌体展示和先导抗体筛选是早期的重点工作。其后较为关键的是表达载体的构建、稳定细胞株的选择、抗体纯化以及后继相关药学研究的工作，如果涉及抗体结构改造（如构建双特异性抗体/人源化修饰或为延长半衰期的结构修饰）的话，筛选菌株和抗体优化的工作量也是巨大的。

图2 单域抗体药物开发一般流程（来自http://www.genscript.com.cn）

这个问题是最早让本喵困惑的。在Cell Discovery的那篇文章发表之前，笔者根据康宁杰瑞的有关专利（申请号CN201510465481），明确披露KN035是Hu56V2-Fc，其约360个氨基酸组成，序列中包含单域抗体部分128个氨基酸。具体的氨基酸序列如图1中序列No：48，这里的Hu56V2-Fc是1个VHH肽链与1个Fc片段的肽链单体连接。

图3 （来自专利申请号CN201510465481）

由于引入Fc段融合蛋白，两条Fc肽链容易形成同二聚体，期间到底是由非共价键形式聚合？还是形成二硫键？专利说明书中提到“可以…形成二聚体”，更进一步的内容没有看到有具体描述。

图4（来自专利申请号CN201510465481）

而发表在Cell Discovery的文中明确指出KN035-Fc是二价抗体，看图5。

图5 （来自Drug Discovery Today 21(7).July 2016)

KN035到底是图8左边的结构，还是右边的结构呢？抑或还形成了以非共价键形式结合的二聚体？如果Fc融合蛋白之间的肽链形成了二硫键，那么整个KN035就是以二聚体的形式存在，才是Cell Discovery文献上所表述的“bivalent”二价抗体？

通过仔细看KN035的制备过程：先用pCDNA4（在文章中阐述的是pcDNA3.1）构建质粒，然后通过哺乳动物细胞HEK293表达（如图6-7），由此推断，KN035的Fc片段通过二硫键连接形成二聚体应该是有可能的。可惜目前公开的资料中并没有关于鉴定其二聚体结构的实验，所以本喵也只能从片言只语中臆测KN035可能是形成了完整的二硫键，是以二聚体形式存在（如图8-b）。果真如此，KN035的实际分子量已接近70KD，远超普通单域抗体15KD的大小。

图6（来自Drug Discovery Today 21(7).July 2016)

图7（来自专利申请号CN201510465481）

作为一只好奇害不死的猫，本喵从专利和Cell Discovery文献中发现其只仅仅提到HEK293。HEK293难道就是康宁杰瑞提交的申报资料中KN035的生产工艺用到的细胞吗？

做抗体产业化工艺研究的人都知道，目前已经上市的单克隆抗体药物绝大部分都采用CHO作为工程细胞，而HEK293适合大规模工业化生产的细胞株很少，国内尚未有商业化引进，普遍都是适合实验室快速制备mg级样品所用的细胞株。这意味着很可能申报的生产工艺还是CHO？还是如康宁杰瑞官网“大分子工艺平台”一栏中的描述（如图9)已经掌握了HEK293大生产的核心技术？康宁杰瑞的HEK293平台抑或已经可”产业化”了?

图9（来自康宁杰瑞官网）

具有产业化价值的“工程细胞系”不仅要求能够正确表达重组抗体，用于抗体药物生产的“工程细胞”系还需具备以下特性：生长特性良好；异源蛋白表达能力强（20~70 pg/cell/dayPCD），具备正确的翻译后修饰能力；宿主及重组细胞系遗传背景清晰、表型稳定，符合相关法规要求。所以获得稳定可靠高表达的细胞株是做抗体生产工艺研究者追求的目标。虽然有江湖传言KN035还是采用CHO作为工程细胞，尽管如此，本喵挺佩服这个团队筛选细胞株的效率的。根据推算，2013年他们放弃PD1的项目，转而开展PD-L1项目，从2015年申请专利到2016年5月递交临床申请，短短时间里就完成了从HEK293到CHO的切换（一般工程细胞筛选都要至少一年以上哦）。本喵期待公开的进一步消息。

已上市的罗氏PD-L1抑制剂，TECENTRIQ的推荐剂量是1200 mg，每次静脉输注60min，每3周一次。相比于TECENTRIQ，KN035采取皮下注射的方案从提高患者顺应性来说有一定的临床优势，有可能成为患者自我管理的给药方式。根据公开资料，KN035的溶解性相当好，其设计的200mg/ml的药物浓度，自称是“创造了生物药物中浓度最高的制剂”。然而长期皮下注射，其皮肤的刺激性以及免疫应答效应还是值得继续观察的。从公开资料看，康宁杰瑞设计KN035皮下注射制剂， 如果按照专利所述剂量，1mg/kg进行给药，（每周给药一次）。按标准体重人折算，每人份每周应为约70mg。按照4次为一个给药周期的话，每个周期的用量达到280mg，这对将来项目设计生产产能来说也是有相当大的压力。

根据披露的Phase I 临床试验方案，2017年3月recieved的DoseEscalation Study试验设置了六个剂量组来测KN035的安全性和剂量耐受性，比专利中提到的药效最佳剂量1mg/kg，向下再设计了两个剂量0.1mg/kg, 0.3mg/kg；而早先2016年6月的DoseEscalation Study of The Safety and Pharmacokinetics试验只设置了四个剂量组，1、2.5、5、10mg/kg。如图10（此处本喵忍不住又多想了一下）

图10（来自Clinnicaltrial.gov）

人体免疫系统相当复杂，抗体的剂量是通过一期临床试验决定的，无论给药量高或者低，都是通过试验结果分析得来的，我们无法通过机理来推测，有时候也很难基于已有的知识来解释。比如BMS的Urelumab，早期试验由于毒性太大已经失败的项目，后来将剂量减低了10倍之后效果相当好。

将抗体静脉注射改为皮下注射的案例还是有的。例如罗氏公司采Halozyme公司的透明质酸酶的重组蛋白rHUPH20，能降解类似透明胶的细胞组织空间。在注射郝赛汀的同时，联合注射rHUPH20可以提高5倍以上的剂量，通过皮下注射，原来5～10毫升的注射量可以改为1～2毫升。2013年郝赛汀皮下制剂在欧盟获批。研究数据表明，使用赫赛汀皮下制剂的疗效与静脉使用相仿，药物血浆水平也不低于后者（ClinicalTrials.gov 标识号 NCT00950300）。

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